Investigating the function of Cx26-I30N and D50Y mutations in squamous cell carcinoma cell line SCC-25

Abstract

Gap junctions are responsible for cell homeostasis and provide cell-cell and cell-ECM communications in multicellular organisms. Gap junction hemichannels consist of connexin (Cx) proteins which functions are crucial for human physiology. Moreover, Cx mutations are associated with various genetic diseases. For example, more than 10 missense mutations in the Cx26 gene cause keratitis-ichthyosis-deafness (KID) syndrome. Among these, Cx26-I30N and Cx26-D50Y cause to form abnormal hemichannels and allow excessive calcium influx into the cell. Furthermore, KID patients have higher squamous cell carcinoma (SCC) incidence and SCC is seen at an earlier age in these patients. Immunohistochemistry stainings have demonstrated aberrant E-cadherin and B-catenin spread in KID patients' samples. In this study, we aimed to effects of Cx26-I30N and Cx26-D50Y mutations associated with KID syndrome in human epithelial SCC cell line SCC-25. For this purpose, stable MSCV, Cx26-WT, Cx26-I30N and Cx26-D50Y cell lines were generated and RTqPCR, Western blotting, immunostaining and MTT assays were done for expression level, localization and viability analysis. For these 4 different cell conditions, a significant increase was detected at Cx26 mRNA levels, but not at protein levels. No difference was found in Cx43 level, which is abundant in epithelial tissue, and was localized in the perinuclear area like Cx26. Additionally, E-cadherin protein levels increased and their localization changed in parallel with the mutations from the perinuclear area to the plasma membrane. Moreover, significant decreases in viability were observed in cells grown in high extracellular Ca2+ medium compared to control in contrast to cells grown in Ca2+-free medium.

Oluklu bağlantılar çok hücreli canlılarda, hücre homeostazından sorumludur ve hücre-hücre ve hücre-ECM iletişimini sağlar. Oluklu bağlantı yarıkanalları, insan fizyolojisi için çok önemli olan işlevleri olan connexin (Cx) proteinlerinden oluşur. Ayrıca, Cx mutasyonları çeşitli genetik hastalıklarla ilişkilidir. Örneğin, Cx26 genindeki 10'dan fazla hatalı mutasyon, Keratit-İktiyozis-Sağırlık (KID) sendromuna neden olur. Bunlar arasında Cx26-I30N ve Cx26-D50Y anormal yarı kanallar oluşturarak hücre içine aşırı kalsiyum girişine izin verir. Ayrıca, KID hastalarında skuamöz hücreli karsinom (SCC) insidansı daha yüksektir ve bu hastalarda SCC daha erken yaşta görülür. İmmünohistokimya boyamaları, KID hastalarının örneklerinde anormal E-cadherin ve B-catenin yayılımı göstermiştir. Bu çalışmada, insan epitelyal SCC hücre hattı SCC-25'te KID sendromu ile ilişkili Cx26-I30N ve Cx26-D50Y mutasyonlarının etkilerini araştırmayı amaçladık. Bu amaçla stabil MSCV, Cx26-WT, Cx26-I30N ve Cx26-D50Y hücre hatları oluşturuldu ve ekspresyon seviyesi, lokalizasyon ve canlılık analizi için RT-qPCR, Western blot, immün boyama ve MTT testleri yapıldı. Bu 4 farklı hücre durumu için Cx26 mRNA seviyelerinde önemli bir artış tespit edildi, ancak protein seviyelerinde tespit edilmedi. Epitel dokusunda bol olan ve Cx26 gibi perinükleer bölgede lokalize olan Cx43 düzeyinde fark bulunmadı. Ek olarak, mutasyonlara paralel olarak E-cadherin protein seviyeleri artmış ve lokalizasyonları perinükleer alandan plazma membranına doğru değişmiştir. Ayrıca, Ca2+'suz ortamda büyütülen hücrelerin aksine, kontrole kıyasla yüksek hücre dışı Ca2+ ortamında büyütülen hücrelerde canlılıkta önemli düşüşler gözlendi.