Molecular characterization of the GTF2A-1 antisense long non-coding RNA

Abstract

One of the essential events in cell regulation and normal development of an organism is apoptosis. The dysregulation of apoptosis is associated with diseases such as cancer. Apoptosis induction can kill cancer cells without harming the individual. For this purpose, new methods are developed to fight the cancer cells. One of the novel approaches is based on long non-coding RNAs (lncRNAs). LncRNAs are differentially expressed in cancer cells and they regulate and interact essential pathways. The ones related to apoptosis are the targets. In this study, target lncRNA was determined based on RNA-Seq data. Then apoptosis was induced in HeLa cells with cisplatin and qRT-PCR was performed with isolated RNAs from the cells to validate the data with regard to upregulation of GTF2A-1 anti-sense lncRNA in apoptosis. Then GapmeR specific to target lncRNA was designed and transfected into HeLa cells in order to induce apoptosis. After induction of apoptosis, total RNA and protein were isolated from the cells. qRTPCR was performed to validate the RNA-Seq data. Western blotting was performed in order to characterize the target lncRNA by controlling its effects on different apoptosis pathways. Western blotting results are showing resemblance between GTF2A-1 antisense lncRNA silencing-induced apoptosis and cisplatin-induced apoptosis. The western blotting result of Cytochrome c is interesting because its amount is decreased in GTF2A- 1 anti-sense lncRNA silencing-induced apoptosis. The candidate, GTF2A-1 anti-sense lncRNA, is directly regulating the apoptosis in HeLa cells and in this study, some of the pathways that are regulated with this lncRNA were shown.

Apoptoz, kontrollü hücre ölümü demektir ve hücre içi dengelerin sağlanması ve hücrelerin normal gelişimi konusunda çok önemli roller oynar. Apoptoz mekanizmasının bir şekilde düzgün çalışmadığı durumlar genel olarak hastalık durumlarıdır. Bu hastalıklardan biri de kanserdir. Apoptozun indüklenmesi, bu kanser hücrelerini bireydeki diğer dokulara zarar vermeden öldürebilir. Bu sebeple, kanser hücreleri ile mücadelede apoptozun indüklenmesi temelinde yeni metotlar geliştirilmektedir. Geliştirlen yeni metotlardan birisi uzun kodlamayan RNAları (ukmRNA) kullanarak apoptozu indüklemektir. Bazı ukmRNAlar kanser hücrelerinde apoptozu kontrol ederler. Hedefler apoptoz ile ilişkili ukmRNAlar arasından seçilir. Bu ukmRNAların karakterizasyonu ve apoptozla olan ilişkilerinin bulunması, kansere karşı savaşta yeni yöntemler bulunmasını sağlamıştır ve sağlayacaktır. Bu çalışmada, hedef ukmRNA önceki çalışmadan gelen RNA-Sek datası kullanılarak bulunmuştur. İlk olarak HeLa hücrelerinde sisplatin kullanılarak apoptoz tetiklenmiştir. Sonra bu hücrelerden elde edilen RNAlarla yapılan qRT-PCR deneyinde elde edilen sonuç RNA-Sek datasını doğrulamak için kullanılmıştır. Sonrasında hedef ukmRNAya spesifik GapmeR dizayn edilmiştir ve apoptozu tetiklemek için HeLa hücrelerine transfekte edilmiştir. Apoptozun tetiklenmesinden sonra, hücrelerden total RNA ve protein izole edilmiştir. Sonrasında ukmRNA-Sek datasını doğrulamak için qRT-PCR yapılmıştır. Hedef ukmRNAnın farklı apoptoz yolakları ile ilişkisini anlamak için western blot yapılmıştır. Western blot sonuçları GTF2A-1 antisens ukmRNAsının susturulması ile indüklenen apoptoz ile sisplatin uygulaması ile indüklenen apoptoz arasında benzerlikler göstermektedir. Western blot sonuçları, sitokrom c proteininin GTF2A-1 anti-sens ukmRNAsının susturulması ile indüklenen apoptoz koşullarında azaldığını göstermesi sebebiyle ilgi çekici bir yerde durmaktadır. Yapılan bu çalışmada; seçilen adayın, yani GTF2A-1 anti-sens ukmRNAsının HeLa hücrelerinde apoptozu kontrol ettiği ve apoptozu hangi yolaklar üzerinden kontrol ettiği, birkaç farklı yolak kontrol edilerek gösterilmiştir.